Gdy zapada noc, przewodnicy kończą aktywność oraz chodzą do zakładzie, a szkolne wycieczki kończą zwiedzanie, w waszyngtońskim Instytucie Smithsonian dzieje się coś interesującego. Nocny strażnik Larry Daley (w aktualnej zasługi Ben Stiller) przeżyje najwspanialszą przygodę naszego mieszkania. W pozostałej faz „Nocy w muzeum” Larry stoczy epicką walkę, jaka mogła się odbyć chociaż w najbogatszym zbiorze muzealnym na świecie. Daley będzie potrzebował powstać w opiece przyjaciół-eksponatów.